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在琼脂糖凝胶塞中限制内切核酸酶DNA消化

时间:2019-09-10 09:48 来源: 作者: 365bet体育开户网址 点击:

实验程序
首先,材料1。
缓冲液和溶液1×限制酶缓冲液TE(pH 7)。
6)2。
酶和缓冲液限制酶3
凝胶4用于凝胶脉冲场中的电泳
核酸和寡核苷酸包含在低熔点琼脂糖塞中的基因组DNA中。
将特殊装置置于水浴II和酶消化的最佳温度的方法1上。
如果凝胶塞没有存放在TE中(如通过邮件接收或保持在0的凝胶塞)。
5 mol / LEDTA),然后是TE体积的50倍(pH 7)。
6)在室温下孵育30分钟。
将凝胶塞转移到新的50体积TE(pH 7)。
6)在室温下再孵育30分钟。
否则,直接进入步骤2。
2
将凝胶塞转移到微量离心管中,并向每个管中加入10体积的相应的1×限制酶缓冲液。
在室温下孵育30分钟。
3
取出缓冲液,换上2-3倍体积的新鲜1X限制酶缓冲液。
向每个管中加入20-30单位的每种限制酶,并在对酶最佳的温度下孵育。将YAC DNA孵育3小时后,将哺乳动物DNA孵育5至6小时。
4
如果用单一酶消化DNA,则在消化后将凝胶塞浸泡在20体积的TE(pH 7,4℃)中。
6)英寸
一小时后,按照步骤7进行操作。
如果用多种酶消化DNA,则跳过TE培养并继续进行步骤5。

如果用多于一种酶消化DNA,则在加入第二种酶之前用相应的缓冲液重新平衡凝胶塞。
为确保适当的平衡,使用自动移液器从每个管中尽可能多地去除缓冲液,并用1 ml TE替换。
除去TE并加入1毫升新鲜TE。
在室温下储存30至60分钟。
轻轻取下TE。
6
向每个管中加入10体积的第二个1x限制酶缓冲液,并在室温下孵育30分钟。
如步骤3中所述进行限制酶的消化。
最后,将每个凝胶塞浸入20体积的TE(pH 7,4℃)中。
6)1小时内
7
使用一次性移液器吸头,将凝胶场塞直接轻轻推入脉冲场凝胶孔(槽),以电泳DNA片段。
发展


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